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RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

簡要描述:

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix公司正在出售的產品:結腸癌細胞 RALYL蛋白封閉多肽 牛呼吸道合胞體病毒PCR檢測試劑盒 大鼠凝血子Ⅷ相關抗原(FⅧ-Ag)ELISA檢測試劑盒 呤氧化(XOD)活性比色法檢測試劑盒 潮汐希瓦氏菌 晚期包膜蛋白1抗體

更新時間:2024-01-12

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RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

商品屬性:

產品名稱

規(guī)格

貨號

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

1ml

A-PJ1025

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix

5ml

A-PJ1025

QQ截圖20240110094643.jpg

本制品是采用 SYBR Green 嵌 合 熒 光 法 進 行Real-Time PCR 的專用試劑,本 SYBR Green qPCR Mix將化學修飾的熱啟動 RAPA3G DNA 聚合酶、反應 Buffer、dNTP、SYBR Green 染料等試劑預混在一起,是一種 2×濃度的單組分預混試劑。該制品配有單獨的 ROX 內參染料,可用于需要 ROX 進行孔間校正的定量 PCR 儀。RAPA3G DNA 聚合酶為第三代 DNA 聚合酶,其具有最高的雜質耐受性(對乙醇、胍鹽、肝素具有高的耐受性),因此對于純度較差的 DNA 模板,該 Mix 仍然可以獲得理想的實驗結果。RAPA3G DNA 聚合酶為化學法修飾的 HotStart版本,其在 50℃以下 100%無活性,只有 95℃條件下加熱5min 后才能恢復酶的活力。因此該系統(tǒng)可以有效抑制非特異性 PCR 擴增,極大的提高了 PCR 擴增特異性。該試劑盒的反應緩沖液,可在寬范圍中得到良好的擴增結果、檢測靈敏度更高、信號更強。
包裝
規(guī) 格
2×RAPA3G SYBR
Green qPCR Mix
50×ROX Dye
1ml (A2250A) 1 ml 200 μl
5ml (A2250B) 1 ml×5 200 μl
儲存:
請避光置于-20℃以下可保存3年。該試劑經 30 次凍融后性能無下降,因此不使用時請置于-20℃避光保存。
操作方法
1. 根據機型選擇步驟 A 或 B
A: 需要添加 ROX 染料進行反應孔間信號矯正的 Real-TimePCR 儀,包括:ABI PRISM7900HT, 7300/7500/7500 FastReal-Time PCR (Applied Biosystems);Mx3000P(Stratagene)等。按照如下組分配制 20 μl PCR 反應體系:終濃度
RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
50×ROX Reference Dye 0.4 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
注意:引物用量有時可提高到 0.8 μl 以提高擴增效率。B:無需添加 ROX 染料進行反應孔間信號矯正的 Real-TimePCR 儀,包括:LightCycler (Roche Diagnostics); CFX96Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ);Line-Gene等。按照如下組分配制 20 μl PCR 反應體系:終濃度
RAPA3G SYBR Green qPCR Mix 10 μl 1×
PCR Forward Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μl 0.2 μM
DNA 模板 0.5~2 μl
ddH2O Up to 20 μl
2. 進行 Real-Time PCR 反應,通常采用兩步法,程序如下:
 Stage 1: 95℃ 5min*
 Stage 2: 95℃ 10s
60℃ 20s 40 cycles
 Stage 3: Dissociation analysis
注意:由于該酶為化學修飾的熱啟動 RAPA3G DNA 聚合酶,必須于 95℃加熱 5min 才能恢復酶的活性,該熱啟動步驟不能縮短時間。
3. 反應結束后確認 Real-Time PCR 的擴增曲線、融解曲線和標準曲線。

65.jpg

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PCR基本步驟及注意事項?

一、實驗原理

PCR是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法,它類似于生物體內DNA的復制。在生物體內DNA復制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而體外PCR反應同樣需要類似的成分,有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設計的特定序列,實現對特定位置的擴增;PCR Buffer提供一個反應的緩沖環(huán)境;反應過程同生物體內一樣,DNA雙鏈打開,引物結合模板,延伸形成新鏈。而這些過程在生物體內靠DNA解旋酶解鏈,而在體外在通過控制反應溫度實現的。如常用94℃變性模板DNA打開雙鏈,在退火溫度處引物結合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反復重復此過程即可實現對特定片段DNA的大量擴增。到第三循環(huán)開始才產生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子,進一步循環(huán)地產生出靶DNA區(qū)段的指數加倍。

在擴增后期,由于產物積累,使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線,產物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱為平臺效應。平臺期(Plateau)會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續(xù)大量擴增,達到較高水平。因此,應適當調節(jié)循環(huán)次數,在平臺期前結束反應, 減少非特異性產物。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式,主要包括基因組DNA、質粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產物,cDNA等,但不能為RNA。對于不同類型的模板,其主要不同在于預變性的時間以及模板的量。一般對于大的基因組DNA預變性時間10min足夠,質粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預變性2min、PCR產物預變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA,但仍可做PCR的模板,只不過在第一輪循環(huán)時只有一個引物結合,合成另一條鏈。從第二輪開始,兩個引物均與特異位點結合,從而實現了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進行PCR擴增,原因就在于實現PCR反應的是DNA聚合酶,只能特意識別DNA鏈。

2.對于模版的量來說,一般25ul體系DNA的質量為50—100ng。對于基因組DNA由于其結構比較復雜,提取的濃度也往往比較大,為防止?jié)舛冗^大對PCR造成影響,故需對提取的DNA進行梯度稀釋。否則濃度過高則可能會引起非特異性擴增。對于質粒及PCR產物由于其結構簡單,且提取濃度一般較低,則無需稀釋。

PCR實驗中應該注意的問題有哪些?

沒有ct值

檢測結果遇到沒有Ct值情況,排查是否有以下問題:

1、循環(huán)數不夠(一般不超過45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準);

2、PCR程序設置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時采集,TaqMan法則一般在退火結束時或延伸時采集信號,另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過500ng,根據試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應考慮樣本準備中雜質的引入及反復凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內含子,以確保擴增基因組DNA;上下游引物Tm值超過4℃以上也會影響擴增)。

ct值過晚

在相對定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對定量中, 對低拷貝數的樣品,Ct值會增大, 但是一般不宜超過40循環(huán), 否則定量不準確。

因此,判斷Ct值出現過晚是否屬于非正常情況, 需要根據具體實驗設計和目的進行。

1、擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化;引物或探針設計不合理, 需要重新設計;

2、PCR程序不合適, 改用三步法進行反應, 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度; 退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產物太長。PCR產物設計超過500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進行PCR檢測或將模板進行稀釋。

公司正在出售的產品:

寄生曲霉染料法熒光定量PCR試劑盒

補體1抑制物抗體-IgGELISA試劑盒 C1INH-IgG免費代測試劑

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馬可尼小囊蟲探針法熒光定量PCR試劑盒

蛋白酪氨磷受體BELISA試劑盒

牛腎盂腎炎棒桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

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馬克洛菌探針法熒光定量PCR試劑盒

多胺調節(jié)因子1結合蛋白1ELISA試劑盒

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馬冠狀病毒PCR檢測試劑盒

多藥耐藥關聯蛋白1ELISA試劑盒

牛副流感病毒3型(BPIV-3PCR檢測試劑盒(熒光-PCR)

禽傳染性喉氣管炎病毒(AiLTV)核檢測試劑盒

泛關聯蛋白2ELISA試劑盒

曼氏桿菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒探針法熒光定量PCR試劑盒

類圓線蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒

人肺炎衣原體抗原(Cpn)ELISA檢測試劑盒

皮諾卡菌探針法熒光定量PCR試劑盒

諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒

人集蛋白亞家族成員11(COLEC11)試劑盒elisa

擬枝孢鐮刀菌染料法熒光定量PCR試劑盒

艾美耳球蟲屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

人脆性組氨三聯體(FHIT)ELISA試劑盒

變形桿菌屬通用PCR檢測試劑盒

石膏樣小孢子菌探針法熒光定量PCR試劑盒

α2巨球蛋白(α2-MG)試劑盒 ELISA

RAPA3G SYBR Green qPCR Mix斑點叉尾鮰病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

豬水皰性口炎(VSV)核檢測試劑盒

人補體因子D(CFD)ELISA檢測試劑盒

葡萄糖苷曼氏桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒

 


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